La terapia génica mediante CRISPR representa una de las fronteras más prometedoras de la medicina de precisión, especialmente en el tratamiento de enfermedades mitocondriales, hasta ahora consideradas incurables. En este artículo de Nicolás Jouve se analizan los últimos avances científicos que han permitido superar algunas de las principales barreras técnicas y éticas asociadas a la edición del ADN mitocondrial, abriendo un camino esperanzador hacia posibles terapias personalizadas que podrían transformar el pronóstico de estas patologías.
En un artículo anterior tratamos sobre las innovaciones en la tecnología CRISPR-Cas9 para mejorar los resultados de sus aplicaciones en la modificación directa de las moléculas del ADN con el fin de corregir o eliminar deficiencias genéticas en sus portadores. Sin duda, la terapia génica es una aplicación del mayor interés, y aunque se están realizando muchos ensayos clínicos, los resultados en cuanto a terapias aceptadas por las agencias del medicamento (FDA, EMA, etc.,) son aun limitados.
De momento, esta tecnología se centra en enfermedades monogénicas o en las que la causa principal se debe a alteraciones en el ADN de un gen concreto del genoma nuclear, y no ofrece aun la fiabilidad y seguridad para editar y corregir genes humanos con la precisión deseada. De otro lado, tampoco se ha abordado la posibilidad de corregir las llamadas enfermedades mitocondriales.
La técnica original ha ido dando paso a innovaciones conducentes al aumento de su precisión y eficacia. Hace falta más investigación y queda mucho camino por recorrer hasta poder utilizar CRISPR-Cas9 para editar y restaurar ADN con fines clínicos en el hombre. El mayor problema técnico del que se derivan consecuencias éticas sigue siendo la limpieza y eficiencia del mecanismo molecular que se aplica, principalmente por dos tipos de complicaciones.
En primer lugar, por el riesgo de desbordar la diana del ADN sobre la que se actúa y generar cambios, incluso pérdidas o inserciones de bases (indels) en el lugar que se desea editar. Un factor determinante es el tipo de corte del ADN, pudiendo quedar en los extremos de rotura regiones de cadena sencilla complementarias o no. En el primer caso se puede producir una reparación dirigida por homología o recombinación homóloga (HR), en el segundo, la unión de extremos no homólogos (NHEJ), El resultado es diferente, ya que la NHEJ es propensa a provocar indels y como consecuencia cambios de la información del ADN, lo que lleva a la desactivación funcional del gen, lo que por otro lado puede interesar en algunos casos (CRISPR de interferencia). La recombinación homóloga es preferible cuando se trata de sustituir unas bases del mensaje alterado por las correctas, que es a lo que obedece la terminología de la edición de genes.
En segundo lugar, por acciones indeseadas sobre otras regiones del genoma, “off-target”, de efectos imprevisibles. Por ello, todos los ensayos clínicos que tratan de desarrollar tratamientos de determinadas patologías por medio de CRISPR tienen como objetivo prioritario probar la eficacia y la seguridad de la tecnología mediante una restricción de su acción al detalle concreto de las bases nucleotídicas del gen que se desea modificar o anular.
Téngase en cuenta la dificultad que supone hacer diana en el lugar preciso de un genoma de 3.175 millones de pares de bases de ADN, y del orden de 21.000 genes, de los que interesa incidir solo en un detalle de uno de ellos sin tocar ni alterar el resto de la información genética. Esta precisión es posible gracias al reconocimiento de la secuencia diana mediante el uso de una molécula de ARN guía que se diseña con el fin de que se empareje por complementación de bases del gen sobre el que se desea incidir. Luego la enzima Cas9 se encarga de cortar el ADN y los mecanismos de reparación restaurarán el hueco producido en la región sobre la que se actúa. Las principales modificaciones tecnológicas se han orientado a elevar la precisión del reconocimiento de la región a editar y su posterior reparación en la dirección deseada.
La tecnología que se trata de aplicar es posterior al conocimiento, a veces parcial, de la patología que se desea corregir, pero afortunadamente gracias al Proyecto Genoma Humano hoy se conoce la secuencia de bases nucleotídicas de los genes implicados. Se han descrito varios miles de enfermedades debidas a mutaciones que afectan a las bases nucleotídicas de un gen. La hemofilia, la fibrosis quística, la anemia falciforme, la b-talasemia, la acondroplasia, la colesterolemia, la neurofibromatosis, etc., son solo algunos de los ejemplos de enfermedades monogénicas debidas a la alteración de una o unas pocas bases de un gen distinto en cada caso, sobre las que inicialmente se han centrado las aplicaciones de CRISPR-cas9. La tecnología desarrollada hasta el momento persigue fundamentalmente corregir o eliminar el ADN del gen responsable de la patología, sin descartar otro tipo de actuaciones, como la activación de un gen alternativo dada la existencia de genes duplicados en un genoma que ha de atender las mismas funciones en diferentes tipos de tejidos o momentos del desarrollo. En cualquier caso, la tecnología que se trata de aplicar es muy selectiva respecto a la región del ADN sobre la que se desea incidir, por lo que queda descartada por el momento la acción simultánea sobre varias regiones como sería el caso de las patologías multigénicas.
En el horizonte de la terapia génica se encuentran también las enfermedades debidas a las alteraciones en el ADN extranuclear, también llamado extracromosómico, o mitocondrial (ADNmt). Se trata de una pequeña proporción de ADN que tiene su sede en las mitocondrias de las células, y cuya transmisión tiene lugar solo por vía materna, a través del citoplasma del óvulo. A pesar de su pequeño tamaño en comparación con el genoma nuclear, el ADN mitocondrial es de enorme importancia funcional ya que interviene en el metabolismo celular. Este ADN en forma de anillo alberga 53 genes en sus 16.500 pares de bases. De hecho, el ADNmt de las mitocondrias es un relicto del genoma procariótico que por endosimbiosis hizo posible la evolución de las células procariotas a las eucariotas. Tras este salto evolutivo las mitocondrias se han convertido en las “centrales energéticas” de las células.
Existen algunas enfermedades humanas importantes debidas a alteraciones de los pocos genes que albergan el ADNmt. Entre ellas hay algunas consideradas incurables y que afectan al sistema nervioso central, como el síndrome de Leigh, una degeneración progresiva del sistema nervioso que se manifiesta en los primeros meses de la vida; la neuropatía óptica de Leber, que afecta a la vista; el síndrome de Kearnes-Sayre, que aparece antes de los 20 años de edad y afecta a la vista y al oído; el síndrome de MERRF, que afecta el sistema nervioso, los músculos y otras zonas del cuerpo; o el síndrome de MELAS, que afecta a diversas zonas incluyendo el cerebro y los músculos; etc. A pesar del interés que suscita la genética mitocondrial, la doble membrana mitocondrial ha demostrado ser una barrera formidable para la manipulación genética.
Tratar de corregir el ADN mitocondrial es un reto difícil al que hasta ahora no había sido posible llegar con la tecnología CRIPR-Cas9. Una peculiaridad del ADNmt es su naturaleza multicopia, lo que implica que las mutaciones a menudo se presentan en un estado conocido como “heteroplasmia”, donde tanto el ADNmt mutante como el normal están presentes en la misma célula. El ADNmt normal puede compensar funcionalmente al ADNmt mutante hasta que se alcanza un umbral de expresión, a partir del cual comienzan a manifestarse los síntomas de la enfermedad.
Veamos a continuación dos avances desarrollados para aumentar la precisión y ampliar la utilización de la técnica en el ADN mitocondrial.
Las técnicas del cambio de una sola base
La técnica CRISPR-Cas9 inicial se basa en el reconocimiento y corte del ADN en la región responsable de la alteración que se desea corregir. Tras el reconocimiento de la secuencia del ADN diana mediante el lanzamiento de “dardos” de ARN guía acompañados de la enzima Cas9, se provoca la rotura del ADN y su reparación. Como hemos señalado, Prime-editing evita cortar ambas cadenas, y actúa solo sobre una de ellas. La diferencia en cuanto a los errores en la modificación y eficacia del método son sustanciales y se reducen considerablemente los efectos colaterales.
En cualquier caso, la tendencia es a que se produzca el menor cambio posible en el ADN objeto de la aplicación del CRISPR. Por ello, se está tratando de reducir el efecto de la tecnología y eludir la ruptura de ambas cadenas del ADN (DSB), para evitar la adición o pérdida de bases (indels). Para ello, además del prime-editing, se han desarrollado unas modificaciones en la técnica que permiten reducir los cambios al detalle de sustituir una sola base. De este modo se han desarrollados dos modificaciones de la técnica para conseguir dos clases de cambios, los editores de bases de citosina (CBE) y los editores de bases de adenina (ABE) [1, 2]. En conjunto, se pueden lograr las cuatro mutaciones de transición (C a T, T a C, A a G y G a A) con los sistemas de transcripción CRISPR-Cas disponibles, aunque se han tenido que introducir modificaciones en la nucleasa Cas9 que se aplica en los diferentes casos. Hay que tener en cuenta que muchas de las mutaciones puntuales patógenas, en principio, pueden revertirse mediante un ABE para reducir la edición al cambio de un par de bases A-T por un par de bases G-C.
La extensión de la edición génica al ADN mitocondrial
La edición en el ADNmt supone un reto para los investigadores que están tratando de aplicar esta tecnología al caso de las enfermedades mitocondriales.
CRISPR-Cas9 no puede atravesar la membrana mitocondrial por lo que hasta ahora no había sido posible plantear este tipo de terapia. Recientemente, un equipo de investigación de los Países Bajos ha logrado con éxito los primeros logros en la modificación del ADN mitocondrial [3]. Los científicos han descubierto que el ADNmt se puede modificar mediante la importación de proteínas de edición genética dirigidas a secuencias de ADN específicas. Las nucleasas dirigidas a las mitocondrias escinden y eliminan específicamente el ADNmt mutante en células heteroplásmicas y en modelos animales. Unos organoides –órganos simulados-, de células hepáticas u otras, con diversos grados de heteroplasmia
Para ello se ha recurrido a la adaptación de editores de bases para modificar el ADNmt mediante transiciones precisas de C a T o A a G. Los investigadores han aprovechado esta tecnología para desarrollar modelos de enfermedades mitocondriales y estrategias terapéuticas para su corrección en los organoides. Para ello se crearon líneas de organoides con diversas modificaciones que permitieron estudiar diversas estrategias de modificación del ADN mitocondrial para analizar los posibles efectos correctores de enfermedades mitocondriales. Estos modelos permiten estudiar las consecuencias funcionales de los cambios producidos en determinada posición del ADN mitocondrial. Por ejemplo, se indujo un cambio a Adenina en una mutación patogénica en la base Guanina que se localiza en la posición 15.150 del ADN mitocondrial, lo que mostró efectos funcionales en la producción de ATP en organoides hepáticos adultos humanos. De igual forma, la corrección de la mutación T a C en la posición 4.291 del ADNmt en un modelo de fibroblastos derivados de un paciente con síndrome de Gitelman, una patología pediátrica hereditaria que afecta a los riñones por pérdida de sal y agua, mejoró la función mitocondrial. De este modo, se demostró el potencial de la edición de bases mitocondriales para generar modelos in vitro únicos para el estudio de las enfermedades mitocondriales y corregir funcionalmente las mutaciones del ADN de estos orgánulos con fines terapéuticos futuros.
En esta investigación se introdujeron otras innovaciones de gran interés, como la utilización de nanopartículas lipídicas para la penetración eficiente de los editores de bases mitocondriales de ARNm. Las nanopartículas se han convertido en los vectores de administración in vivo no viral más utilizados para introducir las moléculas que intervienen en la terapia génica.
Los investigadores concluyen que la Edición de Bases en el ADN mitocondrial es una herramienta de edición genética prometedora y precisa para crear y corregir mutaciones mitocondriales en tipos celulares primarios derivados de pacientes, lo que constituye una vía prometedora para la investigación y el desarrollo futuro en medicina mitocondrial. La modificación del ADNmt es ya una realidad que promete revolucionar el campo de la genética mitocondrial [4].
Al conocer el potencial de estas investigaciones, vienen a la memoria casos relativamente recientes relacionados con las enfermedades mitocondriales que por su gravedad e irreversibilidad generaron un gran debate bioético. Así, el caso del bebé Charlie Gard, nacido en Londres a mediados de 2019, y que permaneció conectado a una máquina de respiración por padecer un síndrome de depleción del ADN mitocondrial. En contra de los deseos de los padres y de una elemental bioética personalista, los médicos del Hospital pediátrico Great Ormond de Londres que lo atendieron opinaron que el bebé padecería un daño cerebral irreversible, sin perspectivas de mejoría, por lo que juzgaron que debía retirársele la respiración asistida que mantenía con vida al bebé para que pudiese “morir con dignidad”, lo que fue ratificado por un juez que señaló que por el mejor interés de la vida de Charlie se le debían retirar los apoyos médicos. El caso dio lugar a un gran debate internacional, en contra de la opinión autorizada de otros médicos y sin atender al apoyo del Papa Francisco que medió en favor de los deseos de los padres y que, con buen criterio, señaló que lo digno sería respetar la patria potestad y agotar todas las posibilidades de prolongar la vida del bebé.
Parece un gran error, como tantas veces ocurre en asuntos de bioética, decir que provocar o acelerar la muerte de forma activa o pasiva conduce a una muerte digna, o tratar de justificar la decisión de acabar con la vida del paciente en aras al “mejor interés” del bebé. La muerte si es provocada no puede ser considerada digna y si no hay sufrimiento, como en el caso de Charlie y tantos otros en que se puede aplicar los cuidados paliativos, deja de ser una muerte compasiva para convertirse en un acto de eutanasia.
Es todavía pronto para atender las necesidades de corregir enfermedades mitocondriales pero la buena noticia es que se están dando los primeros pasos para lograrlo. Al mismo tiempo se mejoran los resultados de las técnicas de CRISPR al aumentar la eficacia y disminuir los errores con la llegada de innovaciones como el prime editing o los editores de bases.
Nicolás Jouve
Catedrático Emérito de Genética de la Universidad de Alcalá
Ex miembro del Comité de Bioética de España
Miembro del Observatorio de Bioética
Universidad Católica de Valencia
[1] Kurt IC, Zhou R, Iyer S, et al. CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nat Biotechnol. 2021;39(1):41-46.
[2] Kantor A, McClements ME, MacLaren RE. CRISPR-Cas9 DNA Base-Editing and Prime-Editing. Int J Mol Sci. 2020 28;21(17):6240.
[3] Joore IP, Shehata S, Muffels I, et al. Correction of pathogenic mitochondrial DNA in patient-derived disease models using mitochondrial base editors. PLoS Biol 2025;23(6): e3003207.
[4] Shoop WK, Bacman SR, Barrera-Paez J.D. et al. Mitochondrial gene editing. Nat Rev Methods Primers 2023;3:19.
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