La ingeniería genética ha evolucionado desde sus inicios en los años 80 hasta convertirse en una herramienta de alta precisión en medicina. Con la llegada de tecnologías como CRISPR-Cas9 y su evolución hacia sistemas como el Prime Editing o la reciente recombinación puente, se abre un abanico de posibilidades terapéuticas sin precedentes. Sin embargo, estos avances plantean también importantes desafíos éticos, especialmente cuando se contempla su aplicación en embriones o células germinales. Este artículo analiza el estado actual y las perspectivas futuras de la edición genética desde una mirada bioética.
La Ingeniería Genética que se fraguó en la década de los ochenta trata de modificar directamente las moléculas portadoras de información genética –ADN y ARN- con el fin de cambiar las características genéticas de sus portadores al margen de su ciclo sexual(1). La tecnología que lo ha hecho posible surgió cuando se logró el aislamiento, clonación y manipulación de los ácidos nucleicos, permitiendo transferir moléculas de ADN de unas células a otras, incluso entre diferentes especies, y dando paso a la obtención de los organismos modificados genéticamente (OMG) o “transgénicos”, de cuyas aplicaciones se ha beneficiado la industria farmacológica, la agricultura, la ganadería y la Medicina.
Un paso importante en la progresión de la ingeniería genética fue su aplicación en el hombre para curar enfermedades con base genética o “terapia génica”. A este fin, ha contribuido muy especialmente el Proyecto Genoma Humano, finalizado en abril de 2003, y el desarrollo de una serie de técnicas que tratan de modificar de forma controlada las regiones del genoma responsables de las enfermedades.
La terapia génica incluye varios tipos de actuaciones, sobre las que aún falta tiempo para aumentar su eficacia con la precisión y seguridad deseadas. Entre sus fines está la inserción en el genoma de un gen o una secuencia de ADN, la modificación del nivel de expresión de un gen alterado, su anulación, o su corrección mediante la tecnología de la edición génica. Estas técnicas pueden realizarse en el ADN de cualquier tipo de células humanas, tanto ex vivo, aprovechando los avances en Biología Celular que permiten el cultivo in vitro, como in vivo, mediante una acción directa en los tejidos y células del paciente, y tanto en células somáticas como germinales. Las implicaciones éticas de estas actuaciones son diferentes, pues las modificaciones en las células somáticas solo afectan al individuo en que se efectúan, mientras que cualquier alteración no deseada en las células germinales puede trascender a las generaciones posteriores.
La edición génica CRISPR-Cas9
Aunque se han desarrollado varias técnicas con diferentes perspectivas, coste y eficacia, sin duda la edición génica CRISPR-Cas9 es la que, por su mayor sencillez y precisión, ha concitado el mayor interés desde que fue propuesta para fines terapéuticos por las investigadoras Jenifer Doubna y Emmanuelle Charpentier en 2013(2), premios Nobel de Química de 2020.
CRISPR-Cas9 se basa en el descubrimiento del microbiólogo ilicitano Francisco Juan Martínez Mojica, en el genoma de las bacterias y archaeas, de una región del genoma a la que denominó CRISPR (por las siglas en inglés Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) , implicada en la defensa frente a los ataques de virus bacteriófagos y ADN extraño(3). El sistema actúa mediante la combinación de dos elementos: la síntesis de un ARN guía, para reconocer el ADN invasor, y la acción de una enzima endonucleasa unida a él, llamada Cas, que actúa sobre el ADN invasor y lo corta. Como mecanismo natural, los microorganismos se aprovechan de esta acción para librarse del ADN extraño.
Aunque CRISPR es un mecanismo natural, que funciona como un sistema inmunológico en las bacterias, los investigadores han aprendido a utilizarlo en el laboratorio como herramienta para reconocer y actuar sobre cualquier región de ADN de secuencia conocida. Como metodología aplicada a la terapia génica, se trata de imitar el mecanismo natural para cortar una región del ADN responsable de una alteración y crear las condiciones necesarias para su posterior restauración o silenciamiento.
La técnica CRISPR-Cas9 inicialmente desarrollada trata de cortar el ADN en la región responsable de una alteración fenotípica, mediante su reconocimiento por una molécula de ARN sintetizado al efecto, el ARN guía, a la que se une la enzima Cas9 que actúa cortándolo en un lugar específico. La nucleasa provoca una rotura al mismo nivel en las dos cadenas de la molécula, DSB (Double Strand Breaks), lo que conduce a la estimulación de mecanismos de reparación del ADN cortado.
Existen dos mecanismos principales de reparación del ADN, en función de si los extremos rotos presentan o no regiones de cadena sencilla complementarias. En función de ello, se puede producir una reparación dirigida por homología o recombinación homóloga (HR), o la unión de extremos no homólogos (NHEJ). El resultado es diferente, ya que la HR determina una restauración del punto de corte sin producir la alteración física del ADN, mientras que la NHEJ es propensa a introducir errores, como inserciones y deleciones de bases, que pueden producir cambios de marco de lectura de la información del ADN y codones de paro en la traducción de los genes, lo que lleva a la desactivación funcional de un gen, por lo que esta modalidad de acción recibe el nombre de CRISPR de interferencia. La mayoría de las actuaciones de edición génica tratan de provocar los DSB seguido de HR para corregir la secuencia alterada proporcionando a las células una molécula de ADN análogo a la secuencia del sitio de ruptura, para su utilización como molde de la reparación. Alternativamente, la reparación por NHEJ tiende a generar los errores de inserción o eliminación de regiones del ADN (indels), lo que eventualmente puede interesar si lo que se desea es la inactivación del gen alterado (knockout). El CRISPR de interferencia tiene múltiples aplicaciones tanto básicas, por ejemplo, para conocer las funciones de los genes, como aplicadas, por ejemplo, para anular un oncogén
Para llevar a cabo la edición de la secuencia del ADN que se desea modificar, se requieren dos componentes moleculares. Un ARN guía para reconocer la diana del ADN a editar o anular, y la enzima nucleasa Cas9. El ARN se puede diseñar y sintetizar en el laboratorio gracias a la disponibilidad de bases de datos genómicos que permiten su síntesis específica para el reconocimiento del ADN diana. La nucleasa más utilizada para formar equipo con el ARN guía es la Cas 9 de Streptococcus pyogenes, pero existen otras alternativas, como la Cas13 aislada de Leptotrichia shahii (4) u otras.
Para editar un gen o secuencia de cualquier locus del ADN se han de introducir en las células en que se desea llevar a cabo los dos elementos indicados: el ARN guía y la enzima Cas9. Para ello se utilizan unos vectores adecuados. Comúnmente se usan virus a los que previamente se desarma mediante la eliminación de regiones de su genoma que pudieran afectar a las células receptoras, como los retrovirus y adenovirus atenuados, lentivirus, etc. En los últimos años, se han desarrollado vectores no virales, como nanopartículas lipídicas, nanotubos de carbono, liposomas y electroporación, plásmidos, microinyección u otros (5).
Una vez en el interior de las células, el ARN guía reconoce el ADN diana y la enzima Cas9 lo corta y produce el DSB. Aunque lo ideal sería la utilización in vivo, por razones técnicas y de seguridad la edición se realiza en muchos casos in vitro, en las células extraídas del propio paciente que se cultivan en el laboratorio.
En un artículo previo titulado CRISPR-Cas9, la revolución en el tratamiento de enfermedades genéticas, explicamos algunos detalles más sobre estas técnicas así como sobre su aplicación en terapia génica para corregir algunas patologías, como el cáncer, las enfermedades monogénicas, etc.. Una extensión de estas mismas cuestiones fue objeto de exposición en el Congreso de Genética celebrado en julio de 2024 en la Universidad Católica de Valencia.
La tecnología no está exenta de dificultades relacionadas con su precisión y seguridad, lo que ha determinado una serie de incertidumbres y ha obligado a desarrollar modificaciones de la técnica, y a emprender nuevas investigaciones y ensayos clínicos para garantizar la seguridad y eficacia como paso previo y obligado para su aprobación por las agencias nacionales e internacionales del medicamento.
Hace un año nos encontrábamos en un momento de gran expectación, en el umbral de la segunda generación de la tecnología CRISPR con fines terapéuticos. En los últimos meses han aparecido novedades tecnológicas que amplían las perspectivas y permiten emprender y extender nuevas aplicaciones.
Objetivo: aumentar la precisión. La innovación “Prime Editing”
Aunque la precisión de la tecnología CRISPR-Cas9 es alta en cuanto al reconocimiento de la diana del ADN a eliminar o editar, no lo es tanto en su reparación posterior, pudiendo quedar errores no corregidos u otros efectos fuera de la región que se quiere modificar. Como consecuencia, hay problemas de seguridad, por lo que se han desarrollado innovaciones para mejorar tanto la eficacia como su precisión, tratando de reducir los errores.
En 2019 surgió una variante de la tecnología denominada Prime-Editing(6). Esta nueva técnica utiliza una nucleasa modificada para cortar únicamente una de las dos cadenas del ADN en lugar de provocar el corte en las dos cadenas (DSB). Otra novedad era la utilización de una enzima nickasa programable fusionada a una enzima transcriptasa inversa, y un ARN guía extendido que especifica el sitio diana y moldea la edición genómica deseada. La secuencia de ARN se programa mediante su síntesis artificial para actuar sobre la región específica del genoma. Una vez reconocida esta, se formaría un tríplex con las dos cadenas del ADN diana y se promueve la síntesis del ADN a editar utilizando como molde el ARN.
Esta nueva tecnología ha sido sometida a ensayos preclínicos e incluso clínicos. Así, la empresa Prime Medicine, que realizó ensayos preclínicos en ratones con buenos resultados, promovió el primer ensayo clínico de utilización de Prime Editin, denominado PM359, que fue aprobado en 2019. Se trataba de corregir una enfermedad rara monogénica recesiva, la granulomatosa crónica (CGD)(7). Esta patología potencialmente mortal se debe a una deficiencia inmunológica frente a infecciones bacterianas y fúngicas consecuencia de la falta de funcionalidad de los macrófagos neutrófilos encargados de la defensa frente a ese tipo de agentes infecciosos. Aunque es pronto para evaluar los resultados, tras la aplicación de Prime Editing en células madre de los glóbulos blancos CD34+ de un joven de 18 años con CGD y su trasplante autólogo, no se registraron efectos secundarios al cabo de un mes y, lo más importante, se apreció una terapia celular al observarse la funcionalidad del gen responsable de la síntesis de la enzima implicada en la patología en la mayoría de las células. Los responsables del ensayo señalan que este nivel de restauración es suficiente para proporcionar un impulso significativo al sistema inmunológico del paciente. A pesar de todo, sigue quedando un importante margen de incertidumbre y hacen falta más evidencias en nuevos ensayos clínicos cuyos resultados deben estudiarse a más largo plazo.
En principio, todo parece prever una sustancial mejora del Prime Editing respecto a la técnica CRISPR-Cas9 inicial, por su mayor versatilidad, especificidad y precisión, especialmente al no requerir roturas de doble cadena del ADN y por su capacidad de realizar prácticamente cualquier sustitución, inserción o deleción pequeña en el ADN de las células tratadas.
Más allá de CRISPR. El “bridge editing” o “recombinación puente”
La revista Nature ha publicado hace unos meses una nueva tecnología basada en CRISPR, pero con una perspectiva mayor en cuanto a la extensión de la región del ADN a modificar.
Dado que este nuevo sistema se basa en un mecanismo molecular distinto, el de la “transposición”, veamos brevemente en que consiste. La transposición es un fenómeno natural de gran importancia evolutiva por su implicación en la remodelación genómica. Este mecanismo se basa en la capacidad que tienen los llamados “elementos móviles”, o “elementos transponibles”, consistentes en piezas de ADN de extensión variable, de trasladarse, expandirse y producir deleciones, adiciones o inversiones en el genoma de muchas especies, lo que constituye un modo natural de producción de diversidad genética. Se trata de un mecanismo descubierto en los años cincuenta por la investigadora americana Barbara McClintock (1902-1992), de la Universidad de Cornell. El descubrimiento tuvo lugar en la planta del maíz, aunque después se ha demostrado su universalidad en todo tipo de especies y, aunque la investigación de la Dra. McClintock no fue valorada en principio, tras la demostración de su existencia en las bacterias, terminó siendo aceptada y se le concedió el premio Nobel de Medicina de 1983(8). Los reordenamientos cromosómicos atribuidos a los elementos móviles o “genes saltarines”, como les denomino la Dra. McClintock, suelen estar orquestados por enzimas implicadas en procesos fundamentales de reparación del ADN, como la recombinación homóloga, o la transposición de material genético extraño por virus u otras fuentes de ADN invasor.
En el genoma humano existen varios tipos de este tipo de elementos transponibles formando parte del genoma no codificante. Se trata de secuencias repetitivas dispersas por el genoma de muchas especies, desde los procariotas a los mamíferos y las plantas superiores. En el caso del genoma humano puede haber más de 2.000.000 que se han ido acumulando a lo largo de la evolución y que llegan a alcanzar un porcentaje importante de nuestro genoma. Una peculiaridad de estos elementos es su capacidad de movilizarse y cambiar de lugar en el genoma mediante unas enzimas llamadas transposasas, integrasas, endonucleasas o recombinasas, que pueden estar codificadas por ellos mismos.
Los elementos de inserción (IS) son un tipo de elementos móviles pequeños que abundan en el genoma de las bacterias y arqueas. Estos elementos IS, de los que existen muy diversos tipos, utilizan una transposasa que ellos mismos codifican y que son capaces de reconocer mediante interacciones proteína-ADN lugares que tienen repeticiones terminales invertidas, como las que muchas veces se producen en lugares de corte DSB.
Basándose en estos elementos, un equipo liderado por el investigador Patrick Hsu, del Departamento de Bioingeniería de la Universidad de California en Palo Alto, ha desarrollado una tecnología denominada “recombinación puente” [9]. Esta designación obedece al hecho de provocar la conexión entre dos regiones de ADN, en la que media el elemento de inserción IS110. Se trata de un tipo de elemento móvil autónomo, que cuando se escinde de la región que ocupa en el genoma, ADN se unen sus extremos no codificantes para producir una molécula de ARN (el ARN puente) que se pliega en dos bucles. Además, el IS110 expresa una recombinasa codificada por el mismo, que se une al ARN. El ARN puente contiene dos bucles internos que codifican tramos de nucleótidos que se aparean uno con el ADN diana y el otro con el ADN donante, que es el propio elemento IS110. Hsu y sus colaboradores demuestran que los bucles de unión a la diana y al donante pueden reprogramarse de forma independiente para dirigir la recombinación específica de secuencia entre dos moléculas de ADN. En el estudio publicado en Nature, se demuestra que los bucles de unión a la diana y al donante pueden reprogramarse independientemente, constituyendo un ARN guía biespecifico, para dirigir la recombinación entre dos moléculas de ADN.
La modularidad permite la inserción de ADN en sitios diana genómicos específicos, así como la escisión e inversión programables del ADN. Esto significa que el sistema puede utilizarse para la inserción de cualquier carga genética deseable en dianas genómicas específicas, incluida una copia funcional de un gen en el lugar en el que se encuentra la versión defectuosa causante de una enfermedad, o en cualquier otra ubicación genómica.
Perspectivas tecnológicas e implicaciones bioéticas
El sistema de recombinación puente IS110 amplía la diversidad de sistemas guiados por ácidos nucleicos más allá de CRISPR y ofrece un mecanismo unificado para los tres reordenamientos fundamentales del ADN que se desean en la edición genómica, inserciones, deleciones o inversiones. La “recombinación puente”, permitiría la inserción de ADN más largos, que los que facilita actualmente CRISPR en los sitios diana genómicos deseados, incluso genes completos. Esto es una ventaja especialmente importante respecto a CRISPR-Cas9 y Prime Editing, ya que hay genes involucrados en patologías con muchos alelos diferentes. Es decir, distintas versiones alteradas de un mismo gen. La aplicación de editing bridge evitaría tener que diseñar distintos ARN guías para cada tipo de alelo a editar al poder sustituirse todo el gen.
La recombinación puente mediante la utilización de elementos móviles puede convertirse en una herramienta precisa y potente para recombinar y reorganizar el ADN de forma programable. Al permitir especificar cualquier secuencia genómica diana y cualquier molécula de ADN donante que se desee insertar en un genoma receptor, se amplía el campo de las aplicaciones terapéuticas por encima de lo que ofrece la tecnología CRISPR-Cas9.
Esta propuesta tecnológica aún no se ha probado en células humanas, pero de lograrse sería un avance significativo respecto a las ya excelentes perspectivas de la tecnología CRISPR-Cas9. A pesar de sus excelentes perspectivas, el ARN puente puede abrir otros aspectos de la modificación genética hacia fines no deseados, ya que supone una invitación a llevar a cabo diseños genómicos más arriesgados, como los que están en la mente de los transhumanistas y biólogos sintéticos. Por ello, es necesario extremar la vigilancia sobre los objetivos de las investigaciones e imponer el principio de precaución y las restricciones de carácter bioético necesarias, especialmente en todo lo que se proponga hacer en embriones y tejido germinal humanos.
Nicolás Jouve
Catedrático Emérito de Genética de la Universidad de Alcalá
Ex miembro del Comité de Bioética de España
Miembro del Observatorio de Bioética
Universidad Católica de Valencia
(1) Rieger, R. Michaelis, A.. Green. M.M. Glossary of Genetics and Cytogenetics. Springer-Verlag, 1976, Berlin.
(2) Doudna, J.A., Charpentier, E. «Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9». Science 2014, 346 (6213), 1258096
(3) Mojica, F.J. «Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning». Mol. Microbiol. 17, 1995: 85–93.
(4) Komor, A.C. et al. «Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage». Nature 533, 2016: 420–424.
(5) Wang, D., Zhang, F., Gao, G. «CRISPR-based therapeutic genome editing: strategies and in vivo delivery by AAV vectors». Cell 181, 2020: 136–150.
(6) Scholefield, J., Harrison, P.T. «Prime editing – an update on the field». Gene Ther, 28, 2021: 396–401.
(7) Chen, P.J., Liu, D.R. «Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation». Nat Rev Genet. 24(3), 2023: 161-177
(8) McClintock, B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl Acad. Sci. USA 36, 1950: 344–355.
(9) Durrant, M.G., Perry, N.T., Pa.i, J.J. et al. Bridge RNAs direct programmable recombination of target and donor DNA. Nature 630 , 2024: 984–993.
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